PCR: un acronimo per indicare una tecnica messa a punto dal dr Mullis e collaboratori nel 1986 che rappresentò una rivoluzione nella biologia molecolare, anche se con dei limiti. La PCR (Polymerase Chain Reaction) o reazione a catena della polimerasi è una tecnica di biologia molecolare che consente di replicare ripetutamente e quindi di amplificare selettivamente un tratto definito di DNA o di RNA (che sono acidi nucleici) di cui si conoscano le sequenze nucleotidiche iniziali e terminali, partendo da una soluzione di DNA o RNA (nucleare, organellare, plasmidico, virale eccetera) in cui questo tratto di acido nucleico è presente in singola copia o in un numero esiguo di copie sicché sia possibile isolare e studiare un qualsiasi tratto di DNA o RNA a partire da un campione biologico da cui è possibile recuperare tracce di DNA.

PCR: come funziona

Una singola molecola di DNA o RNA dunque fa da stampo e da essa attraverso la PCR si possono generare frammenti identici in numero illimitato in un'ora circa. La reazione viene catalizzata dall'enzima DNA-polimerasi responsabile in vivo della replicazione del DNA che avviene durante la mitosi (la divisione e moltiplicazione delle cellule). Come detto prima, un requisito indispensabile per la reazione è la conoscenza delle sequenze alle estremità della regione bersaglio. Nella reazione sono coinvolti due oligonucleotidi a singolo filamento (primer) complementari uno all’estremità 3’ e l’altro all’estremità 5’ del segmento di DNA che si vuole amplificare, che costituiscono gli elementi di innesco dell’attività della DNA polimerasi.

Altri elementi coinvolti nella reazione sono i desossiribonucleotidi e il cloruro di magnesio: i primi servono alla sintesi delle nuove eliche ed il secondo rappresenta il cofattore indispensabile alla DNA polimerasi. La reazione prevede il succedersi di cicli di amplificazione durante cui si alternano tre diverse temperature che rendono possibile rispettivamente:

1) la denaturazione della doppia elica del DNA stampo in due singole eliche (alla temperatura di 95 °C);

2) l’appaiamento degli inneschi oligonucleotidici alle sequenze di DNA a singola elica ad essi complementari e allocati alle estremità del frammento bersaglio (a temperatura compresa tra i 50°C ed i 70°C)

3) l’estensione degli inneschi con aggiunta di nucleotidi nella direzione 5’-3’ ad opera della DNA polimerasi che porta alla sintesi di una nuova elica complementare al DNA stampo (a temperatura compresa tra i 68°C e i 72°C)

DNA Polimerasi termoresistente

Nel 1988 fu isolata una DNA polimerasi termostabile prodotta dal batterio termoresistente Thermus aquaticus (Taq DNA Polimerasi). L’uso di questa polimerasi ha consentito di effettuare la fase di estensione a 72 °C aumentando resa e specificità dei prodotti di reazione e l’automazione del processo. Nel tempo la tecnica è stata affinata con l’aggiunta ad esempio della capacità di proof-reading, che consente la correzione di errori di lettura durante l’amplificazione.

Ad oggi la tecnica è molto usata in campo di biologia molecolare, ma i dati non sempre sono attendibili, ed il rischio di un falso positivo o di un falso negativo sono sempre dietro l’angolo. Da cosa dipendono questi errori?

Intanto la scelta di un primer adeguato e la sua giusta allocazione, poi le possibili contaminazioni del tampone esaminato, ma vi sono anche altre variabili da considerare nella specificità della tecnica. Indubbiamente la PCR consente una applicazione analitica con identificazione della identificazione della presenza o assenza di determinate di determinate sequenze geniche nel campione in esame (identificazione di genomi virali), inoltre il campione amplificato può essere usato come bersaglio bersaglio per ulteriori tecniche di biologia molecolare ulteriori tecniche di biologia molecolare. 

PCR e coronavirus: i tamponi

La conoscenza del tampone per prelievi biologici e valutazione con PCR è arrivata alla moltitudine per la recente pandemia del COVID-19. L’uso a tappeto di tamponi su ampie fasce della popolazione a rischio è stata una delle precauzioni prese per contrastare questo virus ancora di fatto sconosciuto… diverse ricerche scientifiche segnalano come la sequenza genetica completa del coronavirus (a RNA), considerato anche che proprio perché è a RNA muta nel tempo continuamente, e come diversi tratti dell’acido nucleico RNA contenuto nel patrimonio genetico del coronavirus sia in comune con altri virus (ad esempio come quelli della influenza). I dubbi sulla validità di questi tamponi, improvvisamente apparsi e diffusi in tutto l’occidente, sono tanti, il rischio di falsi positivi è possibile, ed è alto proprio perché i primer usati non sono universalmente identificati come validi (esistono 78 tipi di tamponi ad oggi).

Tampone positivo che fare

Ma soprattutto ci si pone il dubbio sulle conseguenze relative ad un tampone: positivo al tampone, sei infetto, puoi infettare, sei malato? Io rispondo no a tutte e tre le domande, e la risposta dipende da quanto detto prima. L’approfondimento tecnico sarà d’obbligo nel tempo. Certo è che il tampone effettuato fornisce anche materiale genetico (DNA) di chi lo subisce: questo dato sensibile permetterebbe ad un operatore di conoscere tutto il DNA di quella persona, e gli errori qua sono improbabili ...  cui prodest? Lo sapremo nel tempo. Il tempo e la storia scorrono. Panta rei. Lo sapremo, presto o tardi.